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欧洲杯SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

  SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳_生物学_自然科学_专业资料。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电 泳 主要内容 ? 实验目的 ? 实验原理 ? 实验材料和试剂 ? 实验步骤 ? 结果处理 实验目的 ? 了解电泳实验原理 ? 掌握电泳实验操作规程 ? 用电泳

  SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电 泳 主要内容 ? 实验目的 ? 实验原理 ? 实验材料和试剂 ? 实验步骤 ? 结果处理 实验目的 ? 了解电泳实验原理 ? 掌握电泳实验操作规程 ? 用电泳方法测定蛋白分子量 实验原理 ? 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计 的 , 样品和浓 缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含 Tris-HCl(pH 8.8)。 系 统 中 所 有 组 分 都 含 有 0 . 1 % 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动 界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面 的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动 样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高, 有利于甘氨酸的离子化,所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋 白质并紧随氯离子之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱 后,SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿 过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。 ? SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋 白质复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液 中的形状,近似于雪茄烟形状的长椭园棒,不同蛋白质 的 SDS 复 合 物 的 短 轴 长 度 都 一 样 ( 约 为 1 8 ?, 即 1.8nm),而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。 这样的SDS-蛋白质复合物,在凝胶电泳中的迁移率, 不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是椭园棒的 长度也就是蛋白质分子量的函数。 ? SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的 聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚 合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液,而经双丙烯酰 胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加,并形成 SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺~丙烯酰胺” 比率的增加而变小,比率 接近 1:20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶 大多按“双丙烯酰胺~丙烯酰胺”为1:29 配制,试 验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。 ? 凝胶的筛分特性取决于它的孔径,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰 胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5~15%的丙烯酰胺所灌制凝 胶的线性分离范围如下表: 丙烯酰胺浓度(%) 线~212 双丙烯酰胺~丙烯酰胺摩尔比为 1:29。 实验材料和试剂 ? 试剂 丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺 十二烷基硫酸钠(SDS) 用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液 TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 样品处理液(50mM Tris-HCl(pH 6.8),100mM DTT(or 5% 巯基乙醇),2% SDS,0.1% 溴酚蓝,10%甘油) 染色液(0.1% 考马斯亮蓝 R250,40% 甲醇10% 冰醋酸) 脱色液(10% 甲醇,10% 冰醋酸) 实验步骤 1.配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试 2.SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 ? 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注 浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面 上小心注入一层水(约2~3mm高),以阻止氧气进入 凝胶溶液; ? 分离胶聚合完全后(约30分钟),倾出覆盖水层,再 用滤纸吸净残留水; ? 制备浓缩胶:按下表给出的数据,在另一小烧杯中制备 一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液,一旦加入 TEMED,马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并 进入下步操作。 ? 聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的 梳子。小心避免混入气泡,再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的 空隙,将凝胶垂直放置于室温下。 ? 在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按1:1体积比 加入样品处理液,在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。 ? 浓缩胶聚合完全后(30分钟),小心移出梳子。把凝胶固定于电 泳装置上,上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出 凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 ? 按予定顺序加样,加样量通常为10~25μl(1.5mm厚的胶)。 ? 将电泳装置与电源相接,凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿 进入分离胶后,把电压提高到15V/cm,继续电泳直至溴酚蓝到 达分离胶底部上方约1cm,然后关闭电源。 ? 从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔 (第一槽)凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 3.用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色 ? 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马 斯亮蓝R250染色。染色1~2小时或过夜。 4.换脱色液脱色,需3~10小时,其间更换多次脱色液至 背景清楚。 ? 此方法检测灵敏度为0.2~1.0 mg。脱色后,可将凝胶 浸于水中,长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为 永久性记录,可对凝胶进行拍照,或将凝胶干燥成胶片。 结果处理 ? 测量并计算分子量 ? 蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式,经37 种蛋白的测定得到以下的关系式 Mw = K(10-bm) lgMw = lgK-bm = K1-bm (1) (2) 其中MW是蛋白质分子量;K和K1为常数 b为斜率,m是电泳迁移率,实际使用的 是相对迁移率mR。 mR=dpr/dBPB

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