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案例展示

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt课件

  SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-polyacrylaPmAGidEe电g泳el electrophoresis SDS-PAGE . 1 实验目的 理解SDS-PAGE的基本原理 掌握SDS-PAGE技术 . 2 操作流程 制胶 制分离胶 制浓缩胶 破碎细菌,提取蛋白质 上样 电泳 凝胶染色 凝胶脱色 . 3 聚丙烯酰胺具有神经性毒性,可从皮 肤、呼吸道吸入,要做好防护措施。 . 4 制分离胶(每4人制一份) 10%分离胶配方(10ml可制1块胶) 水 4.1ml 30%Acrylamide/Bis 凝胶缓冲液(pH8.8) 3.3ml 2.5ml 10%SDS(W/V) 0.1ml 总体积 10ml a. 按表中用量,在一个小烧杯里依次加入水,Acr/Bis,凝 胶缓冲液,SDS,轻轻混匀; b. 加入50uL 10% APS(过硫酸铵),轻轻混匀;加入5uL TEMED(四甲基乙二胺),轻轻混匀; c. 用1ml移液器,将上述混合液加入制胶板中。注意,分离 胶液面离玻璃板上沿约2cm(该空间用来制备浓缩胶), 约3.3ml。 d. 从胶板的左右两侧缓慢各加入200ul去离子水,使分离胶 上表面覆盖一层水,以隔绝. 空气,加速胶的凝固。 5 灌胶 . 6 SDS-PAGE电泳模具 灌胶室(上槽) 玻璃板 螺栓 滑块 旋钮 上盖 制胶架 下槽 . 7 步骤2:制胶 . 8 制浓缩胶(每4人制一份) 4%浓缩胶配方 水 30%Acrylamide/Bis 6.1ml 1.3ml 凝胶缓冲液(pH6.8) 2.5ml 10%SDS(W/V) 0.1ml 总体积 10ml a. 待分离胶完全凝固(约30min,此时分离胶与水层有明显的 分界线),倒掉水层,并用滤纸条吸干残余的水滴; b. 如上表所示,在一个小烧杯里依次加入水,Acr/Bis,凝胶 缓冲液,SDS,轻轻混匀; c. 加入50uL10% APS,轻轻混匀;加入10uL TEMED,轻轻混匀 ; d. 用1ml移液器,将上述混合液. 加入分离胶上层,插入梳子,9 破碎细菌,提取蛋白质(每人制1份 ) 1. 从管中吸取1ml菌液,12000rpm 离心1min,弃上清,向 沉淀中加入100ul PBS,涡旋震荡以充分悬浮细胞沉淀; 2. 吸取10ul蛋白样,加入10ul 2×loading Buffer,混匀 (marker取5ul+ 10ul 2×loading Buffer ,混匀), 于95℃水浴加热15min。 3. 12000rpm离心2min,尽量取上清液待用。 . 10 上样 ?待凝胶完全凝固后,把凝胶固定架取出,垂直向上拔掉梳子。 ?取下固定架(绿色部分),把凝胶连同前后玻璃一起固定在电 泳槽里。 ?向电泳槽加入1X电泳缓冲液至没过上样室。 上样:蛋白样约20ul (10ul蛋白样+10ul2×loading Buffer, 混匀,点样。) marker约15ul (取5ulmarker + 10ul 2X loading Buffer,混匀, 点样。) 每人跑一份蛋白样;每排(.6人)点一 11 ?电泳 先调100V/浓缩胶电泳,当指示染料进 入分离胶后,调至60V/分离胶,电泳至蓝色距 胶板下缘1cm为止。 ?染色 电泳结束后,取出凝胶室,用多用取胶器(钼红色标尺 )撬开玻璃板取胶,剥离凝胶,去掉浓缩胶;将凝胶板浸入考 马斯亮蓝染液摇床染色0.5-1h。 ?脱色 将已染色的凝胶板放入醋酸脱色液脱色1-2d,以背景无 色为准。 . 12 试剂 ?用于制胶的试剂: 丙烯酰胺(Acr)、N,N’一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、过硫 酸铵(APS),四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、 二巯基苏糖醇(DTT)。 ?缓冲液:Tris、HCl。 ?上样缓冲液:Tris、HCl、蔗糖、溴酚蓝、SDS ?电泳缓冲液:Tris、甘氨酸。 ?染色剂:考马斯亮兰R250 浓度为2.5g/L,用甲醇∶醋酸∶蒸 馏水=5∶1∶5的溶液配制(V/V)。 ?脱色剂:醋酸 取冰醋酸7.5ml.、甲醇5ml,加蒸馏水至100ml13 各试剂的作用 ?Acr: Bis: Acr与Bis共同成为分子筛的主体。 ?APS:催化剂 TEMED:加速剂 在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发 丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生 甲叉键交联,从而形成三维网状结构。 DTT:还原剂,使半胱氨酸的二硫键断裂并被还原。 SDS:为去污剂,断裂蛋白质的氢键,破坏蛋白分子的二、三级 结构而去折叠成多肽。解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,从而消 除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 . 14 ? 甘氨酸:由于pI=6.0,在pH=8.8是带负电,向正极泳动。 因解离度小,有效迁移率很低,泳动慢。 ? HCl:强电解质,Cl-有效迁移率大,泳动快。因此,蛋白 质的有效迁移率介于甘氨酸与Cl-之间。 ? 考马斯亮蓝R-250:通过范德瓦尔键与蛋白质结合,它与 不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色,与蛋白质反应虽 然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,常用来对电泳条带染 色。 ? 醋酸:促凝胶脱去蓝色,使背景干净。 . 15 SDS-PAGE的实验原理 ? Acr与Bis在APS和TEMED作用下,形成分子筛,网孔径的大小 决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例 。 ? SDS断裂蛋白质分子内和分子间的氢键,DTT使半胱氨酸的二 硫键断裂并被还原,两者使蛋白质失去空间结构而成多肽链 。SDS与蛋白质形成复合物(1g蛋白质与1.4g SDS结合),而 SDS的负电荷大大超过了蛋白质分子原的电荷量,因而掩盖了 不同种蛋白质间原有的电荷差别,使复合物都带上相同密度 的负电荷。SDS与蛋白质结合后,还可引起构象改变,蛋白质 . 16 胶中的迁移率,不再受蛋白质原的电荷和形状的影响,而取 决于分子量的大小。由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上 带有相等的电荷,它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离 胶,进入分离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,蛋白质 大小与泳动速率成反比。 ?当蛋白质的分子量在15-200kD之间时,电泳迁移率与分子量的 对数呈线性关系。 ?蛋白质被考马斯亮蓝染成蓝色,醋酸脱去凝胶上的蓝色而使背 景无色。 . 17 常用参数 T值:孔径大小取决于T,T值越大,孔径越小,机械性能越强。 T是两个单体(单体丙烯酰胺和N-N’-甲叉双丙烯酰胺)的总百 分浓度: T=(a+b)/m(100%) 30%=(29g+1g)/100ml (a为单体丙烯酰胺的克数,b为N-N’-甲叉双丙烯酰胺的克数, m为缓冲液终体积) C值:交联百分比浓度:C=b/(a+b) (100%) a,b的比例很关键,如果a:b 10,胶脆,硬; 如果a:b 100,胶糊状。 一般有弹性,透明的胶,a. :b比例应在30左右 18 丙烯酰胺储存液的配制 ? 29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液: 丙稀酰胺29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。 储于棕色瓶,4℃避光保存。 使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉 淀,可以过滤。 ? 注意聚丙烯酰胺具有神经性毒性,要做好防护措施。 . 19 ? 通常丙烯酰胺的聚合有两种: 1:化学聚合 常用过硫酸铵,过硫酸钾来引发这个过程,用TEMED, 三乙醇胺作为加速剂,这种引发-增速的催化系统是氧化还原过程。当TEMED溶液中加入过硫酸铵后,过硫酸铵产 生自由基,而丙烯酰胺和自由基作用活化,活化的烯酰胺 形成多聚长链。 2:光聚合 光聚合的催化剂是核黄素,在紫外线作用下,核黄 素生成含自由基的产物,丙烯酰胺和自由基作用活化,活 . 20 丙烯酰胺的聚合方式 ? 通常丙烯酰胺的聚合有两种: 1:化学聚合 常用过硫酸铵,过硫酸钾来引发这个过程,用TEMED,三 乙醇胺作为加速剂,这种引发-增速的催化系统是氧化-还原 过程。当TEMED溶液中加入过硫酸铵后,过硫酸铵产生自由 基,而丙烯酰胺和自由基作用活化,活化的烯酰胺形成多聚 长链。 2:光聚合 光聚合的催化剂是核黄素,在紫外线作用下,核黄素生 成含自由基的产物,丙烯酰胺和自由基作用活化,活化的烯 酰胺形成多聚长链。 . 21 分类 ? 凝胶系统的均匀性: 连续性凝胶电泳 不连续凝胶电泳 ? 按凝胶形状: 圆盘状电泳 平板电泳 ? 被分离的物质是否变性: 非变性、变性(SDS-PAGE) . 22 连续系统和不连续系统 ? PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两 大类, ? 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗 粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。 ? 不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位 梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动主要依靠分子筛 效应和浓缩效应,其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 . 23 非变性胶 ? 在聚丙烯酰胺凝胶中不加入SDS、DTT或尿素而制 成的凝胶属于非变性胶。非变性胶中蛋白质迁移 的速率不仅取决于蛋白质的大小,还包括其电荷 或者形状。 ? 分离的蛋白保留有天然蛋白质构象和生物活性。 . 24 变性胶 ? 变性胶是指在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS(sodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸钠)、DTT (dithiothreitol,二硫苏糖醇)或尿素而制成的凝胶。 ? SDS能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共 价键,使蛋白质变性而改变原有的构象;在包含有过量的 SDS和巯基试剂的蛋白质样品,100℃加热时,二硫键被打 开,蛋白质完全解离成它的亚单位。 ? 由于高级结构的破坏,电泳迁移率主要取决于蛋白质的分 子量。 . 25 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径 1、聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。 2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色 三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,其 中银染的分辨率最高。 . 26 . 27 电泳图 . 28 步骤5:染色、脱色和照相 1. 电泳结束后,取出凝胶室,用多用取胶器(钼红色标尺 注意:根据各班情况,学生点完样,观察一下电 )撬开玻璃板取胶,剥离凝胶,去掉浓缩胶; 泳情况,就可以结束实验了。剩余的染色和脱色 2. 染色和固定:将分离胶放入固定液中浸泡30min或过夜( 步骤比较简单,但很费时间。老师讲解一下就可 放置于摇床上轻轻晃动); 以了。学生可以在当天下午或第二天上午联系张 3. 脱色:倒掉固定液,加入脱色液,在摇床上脱色1-2h(中 晓间娟视老脱色师液,颜到色实变验化准情况备,室可来以观更察换拍一次照脱。色液)。待凝 胶蓝色褪净后,可以给凝胶照相。 . 29

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