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湖北快三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳_化学_自然科学_专业资料。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 实验报告 一、实验目的 1.学习 SDS-PAGE 分离蛋白质的原理; 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳: (1)定义:是指带电粒子

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 实验报告 一、实验目的 1.学习 SDS-PAGE 分离蛋白质的原理; 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳: (1)定义:是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现 象。 (2)影响电泳效果的因素: ①带电颗粒的大小和形状:颗粒越大,电泳速度越慢,反之越快; ②颗粒的电荷数:电荷越少,电泳速度越慢,反之越快; ③溶液的粘度:粘度越大,电泳速度越慢,反之越快; ④溶液的 pH 值:影响被分离物质的解离度,离等电点越近,电泳速度越慢,反 之越快; ⑤电场强度:电场强度越小,电泳速度越慢,反之越快; ⑥离子强度:离子强度越大,电泳速度越慢,反之越快; ⑦电渗现象:电场中,液体相对于固体支持物的相对移动; ⑧支持物筛孔大小:孔径小,电泳速度慢,反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (1)定义 ?聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电 泳。 ?SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS(十二烷基磺酸钠) (2)SDS 的作用 ?SDS 是一种阴离子去垢剂,可与蛋白质结合,形成 SDS-蛋白质复合物。?由 于 SDS 带有大量负电荷,好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质本身带有 的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。?因此在电泳时,蛋白质 分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 (3) SDS-PAGE 分类: ?SDS-PAGE 按照缓冲液 pH 值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大 类: 连续系统:电泳体系中缓冲液 pH 值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下, 主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统:缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度均不连续性,带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,湖北快三因而其分离 条带清晰度及分辨率均较前者佳 (4)聚丙烯胺凝胶的生成: 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体(Acr)和 N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催 化剂作用下聚合而成。在具有自由基时,Acr 和 Bis 就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种: ①化学法 ②光聚合法 ①化学聚合: 引发剂是过硫酸铵(AP),催化剂 N、N、N’、N’-四甲基乙二胺(TEMED), 它的碱基催化 AP 产生氧自由基,激活单体形成自由基,发生聚合。化学聚合形 成的凝胶孔径较小,且重复性好,用来制备分离胶; ②光聚合: 催化剂是核黄素(VB 2 ),在痕量氧存在下,核黄素光解形成无色基,无色基 再被氧氧化成自由基,激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大,且不 稳定,适于制备大孔径的浓缩胶。 聚合反应: (5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点: ①聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链,链与链之间通过甲叉桥 联结在一起; ②链的纵横交错形成三维网状结构,使凝胶具有分子筛的性质; ③网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动,使凝胶具有抗对流的作用; 三、器材试剂 试剂贮备液: 1、 1mol/L HCl48ml,Tris36.6g,TEMED0.23ml,加蒸馏水配成 100ml,pH8.9。 2、 1mol/L HCl48ml,Tris5.98g,TEMED0.46ml,加蒸馏水配成 100ml,pH6.7。 3、 Acr28g,Bis0.735g,加蒸馏水配成 100ml。 4、 Acr10g,Bis2.5g,加蒸馏水配成 100ml。 5、 核黄素 4mg,溶于 100ml 蒸馏水中。 6、 蔗糖 40g,加蒸馏水配成 100ml。 7、 电极缓冲液:Tris6.06g,甘氨酸 28.52g,加蒸馏水配成 1000ml,pH8.3, 用时稀释 10 倍。 8、 过硫酸铵 0.14g,加蒸馏水配成 100ml。 9、 溴酚蓝 1mg 溶于 100ml 蒸馏水中。 10、 脱色溶液:甲醇 5ml,冰醋酸 9ml,加蒸馏水配成 100ml。 11、 蛋白质染色液:考玛斯蓝 G─250 200mg,甲醇 100ml,冰醋酸 20ml,蒸馏 水 80ml,溶解后混合之。 12、 过氧化物酶染色液: 1) 染色液甲:联苯胺─抗坏血酸染色液,染色数分钟。抗坏血酸 70.4mg,联苯 胺溶液 20ml(2g 联苯胺溶于 18ml 用文火加热的冰醋酸中,再加蒸馏水 72ml), 0.6%过氧化氢 20ml,蒸馏水 60ml。 2) 染色液乙:联茴香胺染色液,染色至少 1 小时。0.1mol/L 醋酸缓冲液,pH5.5 (0.82g 醋酸钠溶于 80ml 蒸馏水中,用醋酸调节至 pH5.5,定容至 100ml)。 30%H2O20.25ml 溶于 50ml 蒸馏水中,用时新鲜配制。邻联茴香胺(o─dianisidine) 100mg,溶于 100ml 醋酸缓冲液(1)中。用时取溶液(2)5ml,溶液(3)50ml, 混合之。 四、实验步骤 1.根据分离 DNA 片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶。 1.按要求装配好垂直电泳板,湖北快三两块玻璃板的两侧及底部用 1%的琼脂糖封边,防 止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。 2.将装好的玻璃电泳板倾斜成 45~60℃角。把玻璃板在灌胶支架上固定好。 3.按表 3 配制所需%浓度凝胶的毫升数。分离胶:按 1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1 的 比例,先将贮备液 1,3 和水放在一小烧杯中,过硫酸铵贮备液放在另一小烧杯 中,一起放在真空干燥器中,用线 分钟,取出将过硫酸铵溶液并入, 用玻棒轻轻搅动使之混合,立即注于干洁的玻璃板中。玻璃板垂直放置,用滴管 吸取混合液,沿管壁注入,注意不要进入气泡。胶液注到离玻璃板口 2cm 处,立 即在其表面覆盖少量蒸馏水,静置 1 小时左右,当见到水层下面有一清晰的界面 时,则表明胶已聚合凝固,用吸水纸小心吸去上面水层。 4.加入 TEMED 后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出 时为止。浓缩胶:按 2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4 的比例,同上法制备浓缩胶,连续 平稳加入浓缩胶至离边缘 5mm 处,迅速插入样梳,静置 40 分钟。 5.立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力的夹将梳子夹 在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使成 10°角,可减少液体泄漏 的机会。 6.室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入 0.1XTBE 缓冲液。 7.小心取出梳子,立即用缓冲液冲洗加样孔,因为梳子取出后,梳子上吸附的及 凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产生不规则的表面,将导致以 后 DNA 电泳带型不规则。 8.将 DNA 样品与适量的载样缓冲液混匀后,加到样品孔内,加样时不要产生气泡。 9.接好电极,电压为 1-8V/cm,进行电泳。 10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。 11.电泳毕,切断电源,弃去电泳仪,取出胶床板,小心移去一块玻 璃板,让凝 胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含 0.5ug/ml 的溴化乙锭溶液中,15~30min 后取 出水洗紫外仪下观察结果。 12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng 以上量的 DNA 条带.要求更高的灵敏度, 可用银染。 【注意事项】 1、 固定玻璃板时,两边用力一定要均匀,防止夹坏玻璃板。 2、 凝胶配制过程要迅速, 催化剂 TEMED 要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶. 注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。 3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直,并排除气泡。 4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。 6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。 7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。 8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样. 9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 五、思考题 1、 解释 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的基本原理。 2、 样品溶解液中含有哪几种主要成分?各成分的作用是什么? 3、 影响电泳结果的因素主要有哪些?为什么?

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