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湖北快三非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)

  非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)_生物学_自然科学_专业资料。非变性电泳总结

  非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类 有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法:blue native(BN-PAGE) ,clear native (CN-PAGE) ,quantitative preparative native continuous(QPNC-PAGE) 。 在一个典型的 native PAGE 方法中, 复合物被 CN-PAGE 或 BN-PAGE 分离。 然后可以用其 它分离方法如 SDS-PAGE 或等电聚焦做进一步分离。湖北快三随后切割凝胶,蛋白复合物每一个部 分都被分开。 蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。 这样就可以提供一个 蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。 1. Blue Native PAGE Blue Native PAGE 是最古老的 Native-PAGE 技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白 质鉴定染料的一种电泳方法。 这种方法的缺点是: 考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的 作用, 可能导致复合物的分离; 并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜 在的猝灭作用。 Blue Native PAGE 在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势, 其 分离范围在100KDa-10MDa。在 Blue native PAGE 过程中,最重要的化合物就是考马斯 亮蓝,除了增溶作用以外,蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷,这会导 致即使碱性蛋白在 pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是,蛋白质虽然带有大量的负电荷, 然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小,蛋白质最终迁移 到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。 并且在分离膜蛋白的过程中, 由于带有负电 荷,而不会引起蛋白聚合,与酸性染料的结合,膜蛋白也由疏水性变成亲水性,溶解性大大 提高。 1.2 Clear Native PAGE Clear Native PAGE 是通过除染色以的其它方法如 SLS 鉴定蛋白的电泳技术。 然而, 这种方 法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用,特别是和质谱联用。 Clear Native PAGE 是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白(PI7)的电泳 技术, 分辨率通常比 BN-PAGE 低。 迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。 因此, BN-PAGE 比 CN-PAGE 应用更广泛。然而 CN-PAGE 在考马斯染料分析天然混合物干扰进 一步分析时存在着优势。如测定催化活性(例如线粒体 ATP 合酶)或分离用于荧光共振能 量分析的微量膜蛋白, CN-PAGE 比 BN-PAGE 更温和, 特别是使用洋地黄皂苷时, CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而 BN-PAGE 会导致分解。线粒体 ATP 合酶中的具 有酶活性的低聚物可以用 CN-PAGE 检出,但 BN-PAGE 无法检出。 CN-PAGE 起源于无色非变性 PAGE,是 BN- PAGE 之后出现的技术。既然 CN-PAGE 中没 有带电荷的染料, 蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。 大分子和低聚蛋白 必须有合适的物理参数才能在 CN-PAGE 中分开, 特别是 PI 低于5.4, 分辨率低。 由此看来, CN-PAGE 除了获得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。 优点是条件更温和, 在蛋白质组学研究中具有更大优势。BN-PAGE 和 CN-PAGE 的缓冲液和电泳条件一致,但 是 CN-PAGE 的阴极缓冲液中不含考马斯染料, 而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。 1.3 QPNC-PAGE QPNC-PAGE ( quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis)是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据等电点分离蛋白的高分辨 技术。 这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的 可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定。 1.3.1电泳缓冲液 QPNC-PAGE 是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。在特殊的电泳缓冲 系统(基于 Tris-HCl 和 NaN3)中,一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷,在电场的 正负极之间迁移。 尽管 PH (10.00) 的电泳缓冲液并不与细胞或组织中的生理 PH 相符, 但是在生理 PH (8.00) 的缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分。 分离系统包括电泳槽和分部收集器, 这些 装置要置于冰箱中。 1.3.2凝胶特征 为了得到一个 PAGE 所需的聚合完全的凝胶,聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。最 后,得到均质的含机械稳定和自由的单体或原子。凝胶的孔径很大,因此分子筛作用在电泳 分离中最小化。基于上述原因,凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。待分离的金属蛋 白(如金属分子伴侣,蛋白酶感染性初级因子,金属运输蛋白,淀粉状蛋白,金属酶,金属 肽等)不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。孤立蛋白的生物活性结构(天然或3D 构象) 在 QPNC-PAGE 后不会发生构象变化。所以,金属蛋白和蛋白异构体在 PAGE 中被定量的 分成高纯度的部分。QPNC 与其它电泳技术如 SDS-PAGE,2-DE,等速电泳和 CN- PAGE 等相比被称为“突破性的方法”。 1.3.3 实验方法 (1)储备液 1)200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00,室温 2)200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00,室温 3)40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C,4℃(新鲜) (2)电泳缓冲液 20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00(除气) ,4℃ 电泳槽上部:500ml 电泳缓冲液 电泳槽下部:2000ml 电泳缓冲液 (3)洗脱液 20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00(除气) ,4℃ 洗脱室:700ml 洗脱缓冲液 (4)分离胶 丙烯酰胺4%T 体积40ml 成分: 4ml40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C 4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00 32 mL H2O 200 μ L 10% APS 20 μ L TEMED APS 和 TEMED 最后加入。轻轻搅拌烧瓶中的混合物,注意不能产生气泡。然后把溶液移 入内径为28mm,长为40mm 有刻度的玻璃柱中。加入3ml 正丙醇。60分钟聚合后用电泳 缓冲液冲洗凝胶,然后用4ml 电泳缓冲液覆盖凝胶表面。在室温下凝集69小时。 (5)样品的准备和收集 保持样品(生物液体)温度为4℃。0.3ml 甘油和2.7ml 样品在分离前混合5分钟。然后把处 理好的样品加入到电泳缓冲液的上层。这些蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电(PI10.0) 就是带负电(PI10.0) ,因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。已 分离的蛋白分子用特殊的生理洗脱液连续洗脱, 并用分部收集器收集。 整个分离系统必须在 4℃冰箱中进行。 纯化的,半纯化的和未处理的样品都可以用于 QPNC。样品分离纯化中应该避免类似于蛋 白质沉淀等过程以防止蛋白变性。 化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行 进一步纯化。 1.3.4 定量和鉴定 Fe, Cu, Zn, Ni, Mo, Pd, Co, Mn, Pt, Cr, Cd 和其它金属辅因子可以通 过 ICP-MS(Inductively coupled plasma mass spectroscopy,电感耦合等离子体质谱) 来定性和定量。 因为 PAGE 条带的高纯度和选择性凝集, 相关的结构可以用非变性条件下的 NMR 来分析。 1.3.5 应用 QPNC 的应用对象为分子量6-200kDa 的酸性、 碱性和中性金属蛋白。 在测定血液或其它临 床样品中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重要应用, 因为不正确的金属陪伴蛋白的 折叠。例如超氧化物歧化酶(SOD)的铜陪伴蛋白出现在这些基质中或许预示着神经病变 疾病如肌萎侧索硬化病等。QPNC-PAGE,SEC,ICP-MS 和 NMR 等技术的连用可以得到 病人或潜在的病人液体基质中相关金属蛋白的生理状态的结构。 这一技术可以提高蛋白错折 叠相关疾病的诊断和治疗水平。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步 骤与常见问题分析 分离碱性蛋白 要用低 pH 凝胶系统,并使用以下缓冲液体系: 1. 分离胶:0.06M KOH,0.376M Ac,pH4.3(7.7% T,2.67% C) ; 2. 堆积胶:0.06M KOH,0.063M Ac,pH6.8(3.125% T,25% C) ; 3. 电泳缓冲液:0.14M 2-丙氨酸,0.35M Ac,pH4.5 将正负电极倒置,用甲基绿(0.002%)为示踪剂 实验操作同分离酸性蛋白。 回收 native-PAGE 结束以后,采用电泳的方法进行回收,方法如下: 电泳结束以后, 切取部分染色, 然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析 袋中,加入适量的缓冲液,最后把透析袋放入普通的核酸电 泳槽中,并在电泳槽中加入适量的缓冲液(和透析袋中的缓冲液相同) ,低温电泳2-3小时即 可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。 SDS-PAGE 和 Native-PAGE 的比较 非变性凝胶电泳, 也称为天然凝胶电泳, 与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过 程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点: 1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入 SDS,而变性凝胶的有 SDS。 2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有 SDS,也没有巯基乙醇。 3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小,不像 SDS-PAGE 电泳 中蛋白质分离只与其分子量有关。 4. 非变性凝胶电泳中,酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的,不像 SDS-PAGE 中所有 蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微 酸性环境下进行,蛋白带正电荷,需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。 5. 因为是非变性凝胶电泳,所有的电泳时候电流不能太大,以免电泳时产生的热量太多导 致蛋白变性,而且步骤都要在0-4度的条件下进行,这样才可以保持蛋白质的活性,也可以 降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。 所以与 SDS-PAGE 电泳相比,非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率 问题和解答 1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的?预电泳时要加6×DNA 上样缓冲液 吗?电泳1-2小时再加结合反应产物吗? 预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂,提高分辨率,不加任何物质,一 般30-60分钟后加样电泳。 现在大家都是做 SDS-PAGE 或者双向电泳比较多, 而做非变性电泳的似乎少一些。 而我本人 接触非变形电泳较多,一直认为它还是很有特点的,能够有很多独特应用之处的,所以在此 结合我本人经历向大家介绍一下非变性电泳。 非变性电泳, 蛋白质在电泳过程中是处于非变性的, 电泳时蛋白的迁移率取决于蛋白的电荷 和分子量,非变性电泳在完成电泳后,可以进行蛋白质活性测定(如果是酶的话,可以进行 酶活检测)或者检测同功酶,或含亚基的完整蛋白的分子量,这些特点是 SDS-PAGE 所不具 备的,因为像 SDS-PAGE 使蛋白变性,亚基解离,无法体现含有亚基的蛋白的真实分子量, 也无法进行后续的蛋白活性检测了。 非变性电泳和 SDS-PAGE 相比,其实基本试验操作是相同的,所以在此我也不一一详叙了。 最大的不同就是样品中的蛋白是没有变性的, 所以电泳样品是没有煮沸的, 而且样品处理液 中也是不含去垢剂的。此外的差异还有: 1:在非变性电泳中,体系的 PH 通常为8.8(浓缩胶和分离胶的 PH 8.8)因而大多数蛋白质 在这个条件下是带负电的。当然我想地球上也会有 pI 大于8.8的蛋白质,这样的条件下,要 用低 PH 系统(这个完全是另一套系统,缓冲体系也不同,我这里就不深入了,有兴趣的可 以去参考一下汪家政主编的 《蛋白质技术手册》, )同时把电泳体系得阴极和阳极倒置就好了, 蛋白往胶里跑就行。 2:非变性电泳体系中的离子强度尽量不要太高,离子强度高了会影响蛋白活性;在电泳的 时候发热也比较厉害。但如果离子强度太低了,可能导致非特异性凝聚。我一般缓冲体系 (Tris-Hcl)的离子强度在0.01-0.1mol/L,离子强度是要比 SDS-PAGE 低的。配胶时 Tris-Hcl 浓度同样是要低的。 3:虽然电泳产热比起 western 电转是少很多了,但是还是不能忽视啊~所以我一般做非变 性电泳还是会用冰浴的,安全起见嘛,就怕酶失活。我做 SDS-PAGE 就不会用冰浴。 4:因为蛋白质未变性,含有亚基的蛋白肯定更大,泳动速度也慢(非变性条件下,蛋白所 带的电荷一般来说也更少) ,胶的浓度还是小点好,5%-10%就行,我做 catalase 的非变性 电泳胶的浓度是7%(后面我会给一些操作和应用实例,和图片) 。SDS-PAGE 的条带区分开 主要是靠分子量大小,而非变性电泳的话,分子量和所带电荷的多少都是影响因素,这个值 得注意。 下面我讲两个应用实例,这样让大家也能体会到非变性电泳的实际用途。 (这两个例子都是 本人做的,谢绝转载哦) 第一个例子:电泳检测胰蛋白活力, 这个试验是当初我做蛋白纯化时候做的一个试验, 挺有意思的, 活性电泳的试验结果证实了 我当初从一个公司买的胰蛋白酶粗品没有酶活, 真的是一点都没有! 那个公司的伪劣产品严 重干扰了我的试验进度,最后我还是从肉联厂买的胰脏,自己从头提取。 (这个惨痛的经历 一直教育我,试验材料和试剂什么的,一定要从有信誉的公司买啊) 。 现在和大家分享一下具体细节: 试验用的其实是 SDS-PAGE 体系, 但是样品上样前是没有煮 沸的;而在电泳完成后,用 Tris-Hcl 缓冲液清洗分离胶,可以充分去除 SDS,之后再用清水 清洗3次。置于50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 7.5)中37℃温育8小时,就可以用 R250染色了。 在分离胶里是加了明胶的,作用在于胰蛋白酶能降解明胶,按上述步骤处理过后,就可以染 色,整块胶被 R250染成蓝色背景,而被胰蛋白酶降解的区域不会被染色,仍为透明的(这 和通常凝胶的考马斯亮蓝染色结果正好相反的) ,可以检测胰蛋白酶所处的条带,而且条带 宽度能体现量效关系。还是给图比较直观: (图1) 对了,给篇参考文献: 《用于植物光系统 II 蛋白酶检测的活性染色方法》 好,继续。 第二个例子是我做的过氧化氢酶 catalase 的活性电泳。 这个体系中就没有 SDS 了,样品处理液中我连 β -巯基乙醇都没加。分离胶浓度为7%(pH 8.8) ,浓缩胶浓度为4%(pH 6.8) 。提取的蛋白样品用2×样品处理液(20%(w/v)甘油以及 0.01%(w/v)溴酚蓝,0.125mol/LTris-HCl,pH 6.8)溶解。 过氧化氢酶的染色采用负染色,用蒸馏水将电泳后的聚丙烯酰胺凝胶冲洗2次,然后用0.3% 的 H2O2浸泡凝胶5 min,在浸泡过程中不断震荡染色盘,使之浸泡均匀。浸泡结束后,倒 掉 H2O2液,用蒸馏水将凝胶冲洗2次。再用50 mL2%铁氰化钾和50 mL2%三氯化铁混合液 进行负染色10分钟。直到凝胶在蓝紫色背景上出现草绿色酶带时停止染色。倒掉染色液后, 用蒸馏水冲洗凝胶2次。在这里,顺便给个染色后的效果图: (图2) 我做的植物材料只有一种 catalase 同工酶。其实在很多植物中 catalase 同功酶还是比较多 的,所以往往有好几条带,同工酶还往往是分类,种属鉴定的辅助手段,同工酶和非变性电 泳的用途,大家可以参考以下《电泳》一书(主编何忠效,张树政) ,讲得比我好多啦。里 面胶的配方也讲得很详细。

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