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核酸非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

  核酸非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳_生物学_自然科学_专业资料。这是本人试验操作的实际过程,自认为效果不是很好,希望有心人能给建议和指导!希望能摸索出快速、稳定、电泳条带窄、清晰整齐的电泳方法。

  试剂等 电泳仪、电泳槽、电泳玻璃板(数套) 、鲨鱼齿(67 空,数条) 、边条(数对) 、 加样枪(1ml、5ml、10μl、100μl、200μl) 、脱色摇床、合适大小的托盘数个 95%乙醇、冰醋酸、纱布、医用胶布、剥离硅烷和亲和硅烷(鼎国) 、10% APS (过硫酸铵) (液体状试剂一周内有效) 、TEMED、40%丙烯酰胺(19:1,上海生 工) 、尿素(进口,amresco) ,未注明的均为国产分析纯试剂 试剂配制 亲和硅烷:加 10μl Bind-Silane(亲和硅烷)于 1ml 含 10μl 醋酸的 95%乙醇中, 混匀后备用。 (涂玻璃板用) 固定/脱色液:10%乙醇,蒸馏水配置(可重复用) 硝化液:15ml 硝酸/L 蒸馏水 染色液:1g AgNO3/L 蒸馏水 显色液:30 g Na2CO3/L 蒸馏水(温度不可高,否则显色背景深;可预冷,预冷 后可延长显色时间,有助于减轻显色背景,一般情况时室温即可,显色约需 3~ 5min) 终止显色液:10%冰醋酸 电泳用的 TAE 用蒸馏水配制,制胶用的所有试剂均用双蒸水配制。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 制胶及电泳 (1)胶板的准备:首先确定两块玻璃板是否平整,用去污剂和清水将玻璃 板洗涤干净,并用蒸馏水冲洗,晾干后用 95%乙醇擦拭。 1 用 1~2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、 均匀; (以 平整、光滑的一面为正面) (第一次用的玻璃板最好擦 2~3 次) 2 用加样枪取 1ml 配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面, 用纱布涂抹 均匀; (第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦 2~3 次) 3 用加样枪取 0.5~1ml 配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面,用纱 布涂抹均匀; (擦至感觉特别光滑为止) 4 用 1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀; (可使亲和硅 烷和剥离硅烷分布更未均匀,也可擦去多余部分) 5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物,若有,可吹走;取 0.4mm 的 边条,用纱布擦净,置于长玻璃板的左右两侧,靠边放置,将短玻璃板压于长玻 璃板上,调整边条和短玻璃板的位置,使边条刚好处于边缘位置,但不突出,且 长短玻璃板刚好对其,用夹子固定住玻璃板的两侧;以 1× TAE 配制 1%琼脂糖凝 胶并封住玻璃板底部,待凝胶凝固后用医用胶带密封;将玻璃板凹槽向上小角度 倾斜放置,准备灌胶。 (2)制胶:称取尿素 21g,加入 17ml 双蒸水加热约二三十秒溶解,待冷却 后加入 10ml 5× TBE,冰浴至冰手时加入 7.5ml 40%丙烯酰胺(19:1) ,然后加入 225μl 10%过硫酸铵和 50μl TEMED,快速混匀,准备灌胶。 (3)灌胶:用 5ml 加样枪将制备好的胶液沿玻璃板中部缓慢加入到胶板玻 璃板之间的空隙,注意不能在胶中形成气泡(要多次实验以掌握技巧、控制加样 速度、调节玻璃板倾斜度、手按、竖起玻璃板、便轻敲变加样等) 。胶灌满后, 将鲨鱼齿的平端插入胶液下 5mm 左右(不可过深,以免后面不能加样;也不可 过浅,以免上样量过小) ,同时防止梳齿平端下方出现气泡,于室温下静置 2h, 使胶完全聚合后使用。 (4)预电泳:撕去胶布,两端平行用力拔出梳齿,将玻璃板和梳齿上的多 余凝胶擦洗干净,用蒸馏水漂洗玻璃板、梳子。将玻璃板装到电泳槽上,在下方 电泳槽中加入 1× TBE 至没过玻璃板下端约 1cm,装好电泳槽,加入 1× TBE 至没 过玻璃板上端约 1.5cm 处, 用梳齿刮去玻璃板间隙间的碎胶, 再用 5ml 加样枪将 其吹干净,反转梳齿,将鲨鱼齿插入凝胶胶面下约 0.5mm,并用夹子夹紧,梳齿 间空隙即为加样孔。120w 恒功率,预电泳 30min。 (5)点样:点样前用加样枪吹吸每个上样槽,将梳齿间隙间油状液体吸干 净, 以利于样品更好的沉降。 DNA 样品与上样缓冲液混合, 把 每个加样孔加 5~7μl 的扩增产物。 (6)电泳:140-160w 恒功率电泳,待溴酚蓝至胶的四分之三处时(大约需 要 1.5~2h) ,终止电泳,回收电泳液(可重复用一段时间,当发现电压下降很多 时要更换电泳液,或者补加蒸馏水可继续用一段时间) ,取下胶板,将两块玻璃 板轻轻分开,凝胶留在长玻璃板上。 银染 (1)固定(脱色) :在托盘 1 中加入 1L 固定/脱色液,将有胶的玻璃板胶面 向上放入托盘中,置于脱色摇床上低速摇 6~10min。 (2)洗胶:在托盘 2 中用 1L 蒸馏水漂洗凝胶约 10s。 (3)硝化:在托盘 3 中用 1L 硝化液硝化凝胶 5min。 (4)洗胶:继续在托盘 2 中漂洗凝胶 10s。 (5)染色:在托盘 4 内加入 1L 染色液,将胶板放入托盘中低速摇 15min。 (6)显影:从染色液中取出胶板,立即将胶板置于显色液中低速摇至显色, 直至胶上所有的条带都出现。 (7)定影(终止显色) :从显影液中取出胶板放入终止液中约 1min 以终止 显色。 (8)洗胶:将胶板置于自来水下冲洗正反面直至干净。 (9)干胶:室温下自然干燥,记录实验结果,并用扫描仪或相机记录结果。

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