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二维聚丙烯酰胺凝胶电泳

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  二维聚丙烯酰胺凝胶电泳是结合了等电聚焦技术(根据蛋白质等电点进行分离)以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(根据蛋白质的大小进行分离)的电泳技术。

  通常第一维电泳是等电聚焦,在细管中(φ1~3 mm)中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出,用含有SDS的缓冲液处理30 min,使SDS与蛋白质充分结合。

  将处理过的凝胶条放在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中,结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶,在浓缩胶中被浓缩,在分离胶中依据其分子量大小被分离。

  这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000~2000个蛋白质,有些报道可以分辨出5000~10000个斑点,这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率,它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。

  例如将某个蛋白质的mRNA转入到青蛙的卵母细胞中,通过对转入和未转入细胞的提取液的二维电泳图谱的比较,转入mRNA的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白质斑点,这样就可以直接检测mRNA的翻译结果。二维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工作。目前已有一些计算机控制的系统可以直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。

  目前所应用的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳体系原理是根据蛋白质的两个一级属性,即等电点和相对分子质量的特异性,将蛋白质混合物在电荷(采用等电聚焦方式)和相对分子质量两个方向上进行分离。

  蛋白质混合物在第一维方向上的分离是利用蛋白质等电点的不同在大孔凝胶中将蛋白质分离开,这一过程被称作等电聚焦。蛋白质是两性分子,根据环境PH值的不同分别带正电、负电或零电荷,在ph高于具等电点的位置时,蛋白质带负电,反之带正电。在电场作用下,蛋白质分子会分别向正极或负极漂移,当达到与其等电点相同的ph位置时,蛋白质不带电,就不在发生漂移。根据此原理,开始的等电聚焦在凝胶中预先由小分子载体两性电解质形成ph梯度。

  载体两性电解质是一些可溶性的两性小分子,它们在其PI附近有很高的缓冲能力。当电压加在载体两性电解质混合物之间时,最高PI值的分子(带正电荷最多的分子)移向阴极,最低 PI值的分子(带负电荷最多的分子)移向阳极,其余分子将根据其PI值在两个极值之间分散,形成一个连续的ph梯度;当蛋白质迁移与其等电点相同的ph值位置时,带电状态达到平衡,不再迁移,结果等电点不同的蛋白质分了得到分离。

  蛋白质带电状念取决于其二级结构,因此,没有完全去除二级结构的蛋白质,就可能会产生连续分布的带电状态各异的同一蛋白质的各种构象,从而在2一DE胶上产生条纹现象而降低分辨率。因此,要达到最好的分辨率,蛋白质必须充分变性,如在9mol/L尿素和7mol/L二硫苏糖醇(DTT)条件下变性。

  蛋白质混合物存第二维方向上的分离是按照蛋白质的相对分子质量的大小进行分离。蛋白质是带电的生物大分子,在第二维方向按其相对分子质量分离时,为了消除电荷的干扰,需要采用SDS对蛋白质进行变性处理。我们在2一DE谱上所看到的是不完整的蛋白质亚基分子,而SDS是一种强离子去污剂,作为变性剂与助溶性试剂,可以断裂分子内与分子间的氢键或其他非共价键,使分子变性,破坏蛋白质分子的二级结构与三级结构;同时,强还原试剂巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚成它的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质一SDS胶束,所带的电荷大大超过了蛋白质分了原有的电荷,这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。因此这种胶束在SDS-PAGE中的电泳迁移率不受蛋白质原有电荷的影响,而主要取决于蛋白质或亚基的大小。

  二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白质点经显色后才能被鉴定。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳中的显色是一个重要的步骤,常用的非放射性染色方法中最灵敏的为银染法,其灵敏度可达到l ng甚罕更低;其次是荧光染色以及铜染、锌咪唑负性染色、考马斯亮蓝染色等,后者染色灵敏度为50-100ng。

  由于银染凝胶的质谱鉴定较难,附着在凝胶基质上的肽片段胶内提取效率较低,因此,大多实验室用银染寻找差异蛋白质点,再加大上样量,进行考马斯亮蓝染色,结合胶内酶切提取鉴定蛋白质。

  沉淀是发生化学反应时生成了不溶于反应物所在溶液的物质。从字意上理解就是在重力作用下沉淀去除。污水中的悬浮物质,可以这是一种物理过程,简便易行,效果良好,是污水处理的重要技术之一。

  根据悬浮物质的性质、浓度及絮聚丙烯酰胺凝性能,沉淀可以分为:自然沉淀,絮凝沉淀,区域沉淀。域沉淀的悬浮颗泣浓度较高(5000mg/L以上),颗粒的沉降受到周围其它颗粒影响,颗粒间相对位置保持不变,形成一个整体共同下沉,与澄清水之间有清晰的泥水界面。二次沉淀池与污泥浓缩池中均有区域沉淀发生。

  废水中悬浮固体浓度不高,而且不具有凝聚的性能,在沉淀过程中,固体颗粒不改变形状,也不互相粘合,各自独立地完成沉淀过程。(沉砂池和初沉池的初期沉淀)压缩沉淀发生在高浓度悬浮颗粒的沉降过程中,由于悬浮颗粒浓度很高,颗粒相互之间已挤集成团块结构,互相接触,互相支承,下层颗粒间的水在上层颗粒的重力作用下被挤出,使污泥得到浓缩。二沉池污泥斗中的聚丙烯酰胺浓缩过程以及在浓缩池中污泥的浓缩过程存在压缩沉淀。自由沉淀发生在水中悬浮固体浓度不高,沉淀过程悬浮固体之间互不干扰,颗粒各自单独进行沉淀,颗粒的沉淀轨迹呈直线。整个沉淀过程中,颗粒的物理性质,如形状,大小及比重等不发生变化。这种颗粒在沉砂池中的沉淀是自由沉淀。

  废水中悬浮固体浓度不高,而且不具有凝聚的性能,在沉淀过程中,固体颗粒不改变形状,也不互相粘合,各自独立地完成沉淀过程。(沉砂池和初沉池的初期沉淀)压缩沉淀发生在高浓度悬浮颗粒的沉降过程中,由于悬浮颗粒浓度很高,颗粒相互之间已挤集成团块结构,互相接触,互相支承,下层颗粒间的水在上层颗粒的重力作用下被挤出,使污泥得到浓缩。二沉池污泥斗中的浓缩过程以及在浓缩池中污泥的浓缩过程存在压缩聚丙烯酰胺沉淀。

  絮凝沉淀是颗粒物在水中作絮凝沉淀的过程。在水中投加混凝剂后,其中悬浮物的胶体及分散颗粒在分子力的相互作用下生成絮状体且在沉降过程中它们互相碰撞凝聚,其尺寸和质量不断变大,沉速不断增加。悬浮物的去除率不但取决于沉淀速度,而且与沉淀深度有关。地面水中投加混凝剂后形成的矾花,生活污水中的有机悬浮物,活性污泥在沉淀过程中都会出现絮凝沉淀的现象。

  1)用于污泥脱水根据污泥性质可选用本产品的相应型号,可有效在污泥进入压滤之前进行污泥脱水,脱水时,产生絮团大,不粘滤布,压滤时不散,流泥饼较厚,脱水效率高,泥饼含水率在80%以下。

  2)用于生活污水和有机废水的处理,本产品在配性或碱性介质中均呈现阳电性,这样对污水中悬浮颗粒带阴电荷的污水进行絮凝沉淀,澄清很有效。如生产粮食酒精废水,造纸废水,城市污水处理厂的废水,啤酒废水,味精厂废水,制糖废水,有机含量高 废水、饲料废水,纺织印染废水等,用阳离子聚丙烯酰胺要比用阴离子、非离子聚丙烯酰胺或无机盐类效果要高数倍或数十倍,因为这类废水普遍带阴电荷。

  3)用于以江河水作水源的自来水的处理絮凝剂,用量少,效果好,成本低,特别是和无机絮凝剂复合使用效果更好,它将成为治长江、黄河及其它流域的自来水厂的高效絮凝剂。

  根据一维等电聚焦方式的不同,可将二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分为3种系统。第一种系统是在聚丙烯酰胺管胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,这一系统被称为ISO-DALT系统。 ISO-DALT系统的主要缺点是ph梯度不稳定(如阴极漂移)、重复性差、上样量低,固不利于不同实验室之间进行图谱的比较和数据发布。但通过优化各种电泳条件,仍可得到相对稳定的图谱。针对碱性蛋白质难以分离的问题,后米引入了非平衡DH梯度电泳,该体系主要在碱性蛋白质的分离上提高了性能,但重复性仍比较差。如果在第一维方向上的电泳使用丙烯酰胺和不同PH的丙烯酰胺的衍生物共聚,从而建立起具有ph梯度的固相化胶条,这样的系统称为固相pH梯度等电聚焦系统。IPG—IEF已成为目前通用的一维等电聚焦方式。

  IPG胶条的使用大大提高了二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的重复性和分辨率,从而使二维聚丙烯酰胺凝胶电泳数据的发布和图谱的比较成为可能。在较好的状态下,传统等电聚焦技术和变性(采用十二烷基硫酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳在20cm左右长度的凝胶中可在各自方向上分辨出100个不同的蛋白质条带,因此,理论上二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨能力可达到l0000个点。目前已有实验室在30cm×40cm的大胶上获得这一分离效果;考虑到大多数实验室并不具备运行这种大胶所需要的条件,普通情况下的凝胶(20 cm×20 cm) 分辨到3000个点己是相当不错,而仪酵母菌的全蛋白质组就有6000多个蛋白质,已完成的人类基因组估计有3万~5万个基因,可能表达的蛋白质达数十万,这些将对2一DE技术的分离能力提出挑战。

  大规模的基因组测序技术的问世使人类基因组计划的最终目标得以提前实现。目前所面临的技术挑战是如何分析基因组计划己获得的大量序列信息并加于运用。基因的生物学功能不能只通过对核酸的序列检测来实现,而需要通过对其表达产物—— 蛋白质的结构与功能的研究束进行判定。2-DE的优势是它可以更直观地提供这些表达产物的相对分子质量、等电点、表达丰度的相对量等信息,但它又不可能完全呈现出你所需要关注的蛋白质,一些问题依然是该技术所无法克服的,如低丰度蛋白质点的检测,极酸性和极碱性区蛋白质的分离,高分子质量区蛋白质的分离,疏水性膜蛋白的分离提取。另外,还有2-DE的自动化操作也是一个期待解决的难点。虽然目前已经有能够同时运行10块与20块胶的垂直电泳槽问世,但2-DE仍是一个高强度、难以自动化的蛋白质组分离技术。

  双向电泳利质谱技术的飞速发展,使得蛋白质分折从传统的单个蛋白质分离分析很快转向复杂样品中的大量蛋白质的同时分离和鉴定,加快了高通量蛋白质的分析进程。

  针对二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的一些缺陷和飞速发展的蛋白质组研究对分离技术的需求,近年来升发出许多基于传统二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的改进方法,包括从样本制备、分离到染色各个方面。正是这些方法的开发,保证了二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术能继续存蛋白质组分离中得到更加广泛的应用。

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