您好,欢迎访问湖北快三官网【真.博】!
公司资讯

湖北快三二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理

  2016-05-31·TA获得超过359个赞知道答主回答量:196采纳率:100%帮助的人:70.2万关注

  通常第一维电泳是等电聚焦,在细管中(e68a57a686964616f133φ1~3 mm)中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出,用含有SDS的缓冲液处理30 min,使SDS与蛋白质充分结合。

  将处理过的凝胶条放在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中,结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶,在浓缩胶中被浓缩,在分离胶中依据其分子量大小被分离。

  这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000~2000个蛋白质,有些报道可以分辨出5000~10000个斑点,这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率,它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。

  例如将某个蛋白质的mRNA转入到青蛙的卵母细胞中,通过对转入和未转入细胞的提取液的二维电泳图谱的比较,转入mRNA的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白质斑点,这样就可以直接检测mRNA的翻译结果。二维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工作。目前已有一些计算机控制的系统可以直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。

  目前所应用的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳体系原理是根据蛋白质的两个一级属性,即等电点和相对分子质量的特异性,将蛋白质混合物在电荷(采用等电聚焦方式)和相对分子质量两个方向上进行分离。

  蛋白质混合物在第一维方向上的分离是利用蛋白质等电点的不同在大孔凝胶中将蛋白质分离开,这一过程被称作等电聚焦。蛋白质是两性分子,根据环境PH值的不同分别带正电、负电或零电荷,在ph高于具等电点的位置时,蛋白质带负电,反之带正电。在电场作用下,蛋白质分子会分别向正极或负极漂移,当达到与其等电点相同的ph位置时,蛋白质不带电,就不在发生漂移。根据此原理,开始的等电聚焦在凝胶中预先由小分子载体两性电解质形成ph梯度。

  载体两性电解质是一些可溶性的两性小分子,它们在其PI附近有很高的缓冲能力。当电压加在载体两性电解质混合物之间时,最高PI值的分子(带正电荷最多的分子)移向阴极,最低 PI值的分子(带负电荷最多的分子)移向阳极,其余分子将根据其PI值在两个极值之问分散,形成一个连续的ph梯度;当蛋白质迁移与其等电点相同的ph值位置时,带电状态达到平衡,不再迁移,结果等电点不同的蛋白质分了得到分离。蛋白质带电状念取决于其二级结构,因此,没有完全去除二级结构的蛋白质,就可能会产生连续分布的带电状态各异的同一蛋白质的各种构象,从而在2一DE胶上产生条纹现象而降低分辨率。因此,要达到最好的分辨率,蛋白质必须充分变性,如在9mol/L尿素和7mol/L二硫苏糖醇(DTT)条件下变性。湖北快三

  蛋白质混合物存第二维方向上的分离是按照蛋白质的相对分子质量的大小进行分离。蛋白质是带电的生物大分子,在第二维方向按其相对分子质量分离时,为了消除电荷的干扰,需要采用SDS对蛋白质进行变性处理。我们在2一DE谱上所看到的是不完整的蛋白质亚基分子,而SDS是一种强离子去污剂,作为变性剂与助溶性试剂,可以断裂分子内与分子间的氢键或其他非共价键,使分子变性,破坏蛋白质分子的二级结构与三级结构;同时,强还原试剂巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚成它的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质一SDS胶束,所带的电荷大大超过了蛋白质分了原有的电荷,这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。因此这种胶束在SDS-PAGE中的电泳迁移率不受蛋白质原有电荷的影响,而主要取决于蛋白质或亚基的大小。 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白质点经显色后才能被鉴定。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳中的显色是一个重要的步骤,常用的非放射性染色方法中最灵敏的为银染法,其灵敏度可达到l ng甚罕更低;其次是荧光染色以及铜染、锌咪唑负性染色、考马斯亮蓝染色等,后者染色灵敏度为50-100ng。由于银染凝胶的质谱鉴定较难,附着在凝胶基质上的肽片段胶内提取效率较低,因此,大多实验室用银染寻找差异蛋门质点,再加大上样量,进行考马斯亮蓝染色,结合胶内酶切提取鉴定蛋白质。

联系方式
湖北快三官网【真.博】
联系人:王经理
联系电话:18137874353
邮箱:6507443261@qq.com
地址:株洲市 夹津口镇公川村3组2号
微信
Copyright ©2015-2020 湖北快三官网【真.博】 版权所有 湖北快三官网保留一切权力!