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二维聚丙烯酰胺凝胶电泳原理介绍

  二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术(根据蛋白质等电点进行分离)以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(根据蛋白质的大小进行分离)。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。

  通常第一维电泳是等电聚焦,在细管中(φ1~3 mm)中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出,用含有SDS的缓冲液处理30 min,使SDS与蛋白质充分结合。

  将处理过的凝胶条放在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。欧洲杯在第二维电泳过程中,结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶,在浓缩胶中被浓缩,在分离胶中依据其分子量大小被分离。

  这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000~2000个蛋白质,有些报道可以分辨出5000~10000个斑点,这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率,它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。

  做这个实验的时,我同一批次提取的蛋白,胶跑出的条带都不一致,这是什么原因呢?

  我做WB也不算是新手,自己觉得整个过程也没有什么明显的问题,可是最后发光的时候内参整个是晕开的,分子还连成了一条线,之前没出现过这种情况,所以想请大家帮忙分析下,是胶的问题,蛋白的问题,还是什么别的,谢啦!

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