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蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳

  3.30%丙烯酰胺(pH≤7.0):29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺,溶于60ml水中,加热至37C溶解,补水至100ml,用棕色瓶贮存于室温,几个月后重新配置。

  4.10%过硫酸铵(W/V):1g溶于10ml水中,4C保存数周,尽量现用现配。

  6.10%SDS。将10gSDS溶于80ml重蒸水中并轻缓搅拌(室温低时需水浴加热溶解),再定容至100ml,室温存放。

  8.考马斯亮蓝染色液:0.25g考马斯亮蓝R-250用少量甲醇溶解后,用甲醇(40ml)-乙酸(10ml)水溶液稀释至100ml。

  9.脱色液:90ml甲醇:水(1:1)和10ml冰醋酸配成100ml脱色液

  10.Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3):在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱,94g甘氨酸,加入50ml10%(W/V)的电泳级SDS贮液,用去离子水补至1000ml量则成5×贮液。

  2.取30μl蛋白提取液与30μl样品缓冲液混合,于100℃水浴加热3min使蛋白变性,用微量进样器以50μl的量注入点样孔,不加样槽注入样品缓冲液。

  3.以浓缩胶中100V,分离胶中180V电压进行电泳,至距底线.将电泳后的凝胶取出,置于培养皿中,用蒸馏水冲去残留缓冲液,加入染色液将凝胶完全浸泡其中,放入微波炉内,高火档照射20秒,停留1min,再照射10秒,反复几次至凝胶上色后倒出染色液,用蒸馏水冲去残留染色液,加入脱色液,高火档照射20秒,倒出脱色液,再加入新鲜脱色液照射20秒,重复5-6次,直至背景清晰透明,于凝胶分析仪上成像分析。

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